Rozprawa naukowa nr 508

Bakteriocyny są małymi peptydami o aktywności przeciwdrobnoustrojowej powszechnie produkowanymi przez różne grupy bakterii. Bakteriocyny, które są produkowane przez bakterie fermentacji mlekowej (LAB, ang. lactic acid bacteria) były spożywane przez człowieka od czasów starożytnych wraz z fermentowaną żywnością (mlecznymi napojami fermentowanymi oraz kiszonkami warzywnymi). Wyróżniono cztery klasy bakteriocyn bakterii fermentacji mlekowej różniące się budową. Współcześnie bakteriocyny stosowane są jako biokonserwanty żywności i dodatki do pasz, ale rozpatruje się też ich biomedyczne zastosowania np. w zwalczaniu drobnoustrojów antybiotykoopornych. Co więcej, mogą mieć potencjalne zastosowanie jako środki terapeutyczne np. w modulowaniu składu mikroflory jelitowej, preparaty antywirusowe, a nawet we wspomaganiu terapii antynowotworowych. Diwercyna AS7, będąca przedmiotem badań, jest bakteriocyną klasy IIa produkowaną naturalnie przez Carnobacterium divergens AS7 i posiada silną aktywność przeciwdrobnoustrojową skierowaną przeciwko ludzkim patogenom (zwłaszcza szczepom Listeria monocytogenes). Bakteriocyna ta może mieć szersze zastosowanie niż biokonserwant żywności i dodatek do pasz podnoszący ich jakość. W pracy zaprezentowano badania nad heterologiczną syntezą diwercyny AS7 w celu przeanalizowania jej właściwości (bezpieczeństwa) i działania na komórki nabłonkowe człowieka. Praca podsumowuje jednocześnie aktualny stan wiedzy na temat biomedycznych aplikacji bakteriocyn produkowanych przez bakterie fermentacji mlekowej.
Heterologiczna synteza białek jest sposobem na osiągnięcie preparatów bakteriocyn o wysokim stopniu oczyszczenia, co umożliwia prowadzenie badań (biochemicznych i biomedycznych). Aby przeprowadzić syntezę diwercyny AS7 w układach heterologicznych klonowano sekwencję kodującą dojrzały peptyd w serię wektorów pozwalających na otrzymanie białka w następujących szczepach mikroorganizmów: Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica, pMAD11 oraz pMAD16, a także Lactococcus lactis MG1363. Aby przeanalizować wpływ diwercyny AS7 na ludzkie enterocyty przeprowadzono badania in vitro z wykorzystaniem linii komórkowej Caco-2 (integralności komórek, występowania efektów cytopatycznych oraz apoptozy). Wykorzystano również drożdżowy system dwuhybrydowy w celu zidentyfikowania oddziaływań pomiędzy diwercyną AS7 a białkami człowieka komórek nabłonkowych kodowanych przez bibliotekę cDNA z komórek HeLa.
Diwercyna AS7 jest wydajnie syntetyzowana w komórkach heterologicznych szczepów: Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica pMAD11 oraz pMAD16 a także Lactococcus lactis MG1363. Jej rekombinowane wersje różnią się masą cząsteczkową i właściwościami jednak zachowują aktywność przeciwdrobnoustrojową oraz stabilność termiczną. W testach in vitro nie zaobserwowano negatywnego wpływu na komórki Caco-2 (brak apoptozy, brak efektów cytopatycznych oraz uszkodzeń enterocytów), co pozwala wnioskować, że diwercyna AS7 w testowanym stężeniu nie jest toksyczna dla komórek człowieka. Wykorzystując drożdżowy system dwuhybrydowy zidentyfikowano oddziaływania diwercyny AS7 z białkami człowieka (ALDOA, MAPRE1, RPL13A, SSR2) kluczowymi dla procesów molekularnych takich jak: translacja, transport wewnątrzkomórkowy oraz onkogeneza.
Rekombinowana diwercyna AS7 zachowuje aktywność bakteriobójczą i termostabilność, co umożliwia jej praktyczne zastosowanie. Nie wpływa cytotoksycznie na komórki Caco-2, co wskazuje na bezpieczeństwo jej stosowania, jako biokonserwantu żywności. Oddziałuje ona z białkami człowieka istotnymi dla prawidłowego przebiegu kluczowych procesów komórkowych i może stanowić potencjalny czynnik terapeutyczny.
 

Wprowadzenie. Bakteriocyny są małymi peptydami o aktywności przeciwdrobnoustrojowej powszechnie produkowanymi przez różne grupy bakterii. Bakteriocyny produkowane przez bakterie fermentacji mlekowej (LAB, ang. lactic acid bacteria) były spożywane przez człowieka od czasów starożytnych wraz z fermentowaną żywnością (mlecznymi napojami fermentowanymi oraz kiszonkami warzywnymi). Wyróżniono cztery klasy bakteriocyn bakterii fermentacji mlekowej różniące się budową. Współcześnie bakteriocyny stosowane są jako biokonserwanty żywności i dodatki do pasz, ale rozpatruje się też ich biomedyczne zastosowania np. w zwalczaniu drobnoustrojów antybiotykoopornych. Co więcej, mogą mieć potencjalne zastosowanie jako środki terapeutyczne np. w modulowaniu składu mikroflory jelitowej, preparaty antywirusowe, a nawet we wspomaganiu terapii antynowotworowych. Diwercyna AS7, będąca przedmiotem badań, jest bakteriocyną klasy IIa produkowaną naturalnie przez Carnobacterium divergens AS7 i posiada silną aktywność przeciwdrobnoustrojową skierowaną przeciwko ludzkim patogenom (zwłaszcza szczepom Listeria monocytogenes). Bakteriocyna ta może mieć szersze zastosowanie niż biokonserwant żywności i dodatek do pasz podnoszący ich jakość. W pracy zaprezentowano badania nad heterologiczną syntezą diwercyny AS7 w celu przeanalizowania jej właściwości (bezpieczeństwa) i działania na komórki nabłonkowe człowieka. W pracy podsumowowano jednocześnie aktualny stan wiedzy na temat biomedycznych aplikacji bakteriocyn produkowanych przez bakterie fermentacji mlekowej.
Materiały i metody. Heterologiczna synteza białek jest sposobem na osiągnięcie preparatów bakteriocyn o wysokim stopniu oczyszczenia, co umożliwia prowadzenie badań (biochemicznych i biomedycznych). Aby przeprowadzić syntezę diwercyny AS7 w układach heterologicznych klonowano sekwencję kodującą dojrzały peptyd w serię wektorów pozwalających na otrzymanie białka w następujących szczepach mikroorganizmów: Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica, pMAD11 oraz pMAD16, a także Lactococcus lactis MG1363. Aby przeanalizować wpływ diwercyny AS7 na ludzkie enterocyty przeprowadzono badania in vitro z wykorzystaniem linii komórkowej Caco-2 (integralności komórek, występowania efektów cytopatycznych oraz apoptozy). Wykorzystano również drożdżowy system dwuhybrydowy w celu zidentyfikowania oddziaływań pomiędzy diwercyną AS7 a białkami człowieka komórek nabłonkowych kodowanych przez bibliotekę cDNA z komórek HeLa.
Wyniki. Diwercyna AS7 jest wydajnie syntetyzowana w komórkach heterologicznych szczepów: Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica pMAD11 oraz pMAD16, a także Lactococcus lactis MG1363. Jej rekombinowane wersje różnią się masą cząsteczkową i właściwościami jednak zachowują aktywność przeciwdrobnoustrojową oraz stabilność termiczną. W testach in vitro nie zaobserwowano negatywnego wpływu na komórki Caco-2 (brak apoptozy, brak efektów cytopatycznych oraz uszkodzeń enterocytów), co pozwala wnioskować, że diwercyna AS7 w testowanym stężeniu nie jest toksyczna dla komórek człowieka. Wykorzystując drożdżowy system dwuhybrydowy, zidentyfikowano oddziaływania diwercyny AS7 z białkami człowieka (ALDOA, MAPRE1, RPL13A, SSR2) kluczowymi dla procesów molekularnych takich jak: translacja, transport wewnątrzkomórkowy oraz onkogeneza.
Wnioski. Rekombinowana diwercyna AS7 zachowuje aktywność bakteriobójczą i termostabilność, co umożliwia jej praktyczne zastosowanie. Nie wpływa cytotoksycznie na komórki Caco-2, co wskazuje na bezpieczeństwo jej stosowania, jako biokonserwantu żywności. Oddziałuje ona z białkami człowieka istotnymi dla prawidłowego przebiegu kluczowych procesów komórkowych i może stanowić potencjalny czynnik terapeutyczny.

1. WPROWADZENIE

2. WSTĘP
2.1. Bakteriocyny bakterii fermentacji mlekowej
2.2. Synteza bakteriocyn w układach heterologicznych
2.3. Właściwości bakteriocyn

3. CEL PRACY

4. MATERIAŁY I METODYKA BADAŃ
4.1. Szczepy drobnoustrojów i wykorzystane wektory plazmidowe
4.2. Przygotowanie rekombinowanych wektorów plazmidowych
4.3. Metody wprowadzania konstruktów genetycznych do komórek
4.4. Metody hodowli rekombinowanych szczepów
4.5. Potwierdzenie eksprezji genów i oznaczenie ilości kopii wprowadzanych genów
4.6. Synteza rekombinowanych białek
4.7. Oczyszczanie białek zawierających znaczniki
4.8. Analizy właściwości białek pozyskanych w układach heterologicznych
4.9. Analizy oddziaływań na białka eukariotyczne w drożdżowym systemie dwuhybrydowym

5. WYNIKI BADAŃ I DYSKUSJA
5.1. Heterologiczna synteza diwercyny AS7 w komórkach Escherichia coli
5.2. Heterologiczna synteza rekombinowanej diwercyny AS7 w komórkach Lactococcus lactis
5.3. Heterologiczna synteza diwercyny AS7 w komórkach Pichia methanolica
5.4. Analizy bioinformatyczne właściwości pozyskanych rekombinowanych białek
5.5. Wpływ rekombinowanych białek na komórki nabłonkowe
5.6. Analizy wpływu rekombinowanej diwercyny AS7 na wybrane białka komórek nabłonkowych w modelu in vivo

6. PODSUMOWANIE

7. WNIOSKI KOŃCOWE

8. LITERATURA

Introduction. Bacteriocins are small peptides with antimicrobial activity, which are commonly produced by various groups of bacteria. Bacteriocins produced by lactic acid bacteria (LAB) have been eaten with various foods (fermented dairy products and vegetables) since ancient times. Four classes of LAB bacteriocins have been identified on the basis of their structural characteristics. Nowadays they are used as food preservatives and feed additives, but they can also be used for medicinal purposes, e.g. to deal with antibiotic-resistant bacteria. Moreover, they can also be used as therapeutic agents (e.g. microbiota regulators), alternative antiviral substances or even as anticancer agents. Divercin AS7, which is the object of research, is a class IIa bacteriocin produced by Carnobacterium divergens AS7. It is particularly effective against human pathogens, especially Listeria monocytogenes strains). This bacteriocin could also be used for other purposes than those related with the safety and quality of food and feeds. This publication presents the results of studies on the heterologous synthesis of divercin AS7, analyses its properties (biosafety) and impact on human epithelial cells. It also summarises the current knowledge of the biomedical application of bacteriocins produced by lactic acid bacteria.
Materials and methods. The production of heterologous peptides enables the synthesis of highly purified bacteriocin and biochemical and biomedical investigations. In order to facilitate studies on the expression of divercin AS7 in different heterologous hosts, its mature native coding sequence was cloned in a series of vectors, which allowed its synthesis in Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica, pMAD11 and pMAD16, and Lactococcus lactis MG1363 strains. In vitro investigations were conducted to analyse the impact of divercin AS7 on human enterocytes (cell integrity, cytotoxic effect and apoptosis). A yeast two-hybrid system (Saccharomyces cerevisiae MaV203 strain) was used to identify in vivo interactions between divercin AS7 and human proteins encoded by the cDNA library from human epithelial cells.
Results. Divercin AS7 was effectively synthesised in heterologous hosts, i.e. the Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica pMAD11 and pMAD16, and Lactococcus lactis MG1363 strains. Its recombinant versions differed in molecular weight and properties but retained antibacterial activity and thermal stability. The absence of the apoptotic effect, cytotoxicity or damage to enterocytes (Caco-2 cells) let us conclude that recombinant divercin AS7 is not toxic to human cells. Interactions between divercin AS7 and human epithelial proteins (ALDOA, MAPRE1, RPL13A, SSR2), which is crucial for molecular processes such as translation, intracellular trafficking and oncogenesis, were identified with the yeast two-hybrid system.
Conclusions. Recombinant versions of divercin AS7 retain bactericidal activity and thermostability, which allows their practical application. As there was no cytotoxic effect on Caco-2 cells, it can be safely used as a food biopreservative. It also interacts with the human proteins that are essential for key cellular processes. Therefore, it may be a potential therapeutic agent.