Wydawnictwo
Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu

Bakteriocyny są małymi peptydami o aktywności przeciwdrobnoustrojowej powszechnie produkowanymi przez różne grupy bakterii. Bakteriocyny, które są produkowane przez bakterie fermentacji mlekowej (LAB, ang. lactic acid bacteria) były spożywane przez człowieka od czasów starożytnych wraz z fermentowaną żywnością (mlecznymi napojami fermentowanymi oraz kiszonkami warzywnymi). Wyróżniono cztery klasy bakteriocyn bakterii fermentacji mlekowej różniące się budową. Współcześnie bakteriocyny stosowane są jako biokonserwanty żywności i dodatki do pasz, ale rozpatruje się też ich biomedyczne zastosowania np. w zwalczaniu drobnoustrojów antybiotykoopornych. Co więcej, mogą mieć potencjalne zastosowanie jako środki terapeutyczne np. w modulowaniu składu mikroflory jelitowej, preparaty antywirusowe, a nawet we wspomaganiu terapii antynowotworowych. Diwercyna AS7, będąca przedmiotem badań, jest bakteriocyną klasy IIa produkowaną naturalnie przez Carnobacterium divergens AS7 i posiada silną aktywność przeciwdrobnoustrojową skierowaną przeciwko ludzkim patogenom (zwłaszcza szczepom Listeria monocytogenes). Bakteriocyna ta może mieć szersze zastosowanie niż biokonserwant żywności i dodatek do pasz podnoszący ich jakość. W pracy zaprezentowano badania nad heterologiczną syntezą diwercyny AS7 w celu przeanalizowania jej właściwości (bezpieczeństwa) i działania na komórki nabłonkowe człowieka. Praca podsumowuje jednocześnie aktualny stan wiedzy na temat biomedycznych aplikacji bakteriocyn produkowanych przez bakterie fermentacji mlekowej.
Heterologiczna synteza białek jest sposobem na osiągnięcie preparatów bakteriocyn o wysokim stopniu oczyszczenia, co umożliwia prowadzenie badań (biochemicznych i biomedycznych). Aby przeprowadzić syntezę diwercyny AS7 w układach heterologicznych klonowano sekwencję kodującą dojrzały peptyd w serię wektorów pozwalających na otrzymanie białka w następujących szczepach mikroorganizmów: Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica, pMAD11 oraz pMAD16, a także Lactococcus lactis MG1363. Aby przeanalizować wpływ diwercyny AS7 na ludzkie enterocyty przeprowadzono badania in vitro z wykorzystaniem linii komórkowej Caco-2 (integralności komórek, występowania efektów cytopatycznych oraz apoptozy). Wykorzystano również drożdżowy system dwuhybrydowy w celu zidentyfikowania oddziaływań pomiędzy diwercyną AS7 a białkami człowieka komórek nabłonkowych kodowanych przez bibliotekę cDNA z komórek HeLa.
Diwercyna AS7 jest wydajnie syntetyzowana w komórkach heterologicznych szczepów: Escherichia coli BL21DE3pLys, Pichia methanolica pMAD11 oraz pMAD16 a także Lactococcus lactis MG1363. Jej rekombinowane wersje różnią się masą cząsteczkową i właściwościami jednak zachowują aktywność przeciwdrobnoustrojową oraz stabilność termiczną. W testach in vitro nie zaobserwowano negatywnego wpływu na komórki Caco-2 (brak apoptozy, brak efektów cytopatycznych oraz uszkodzeń enterocytów), co pozwala wnioskować, że diwercyna AS7 w testowanym stężeniu nie jest toksyczna dla komórek człowieka. Wykorzystując drożdżowy system dwuhybrydowy zidentyfikowano oddziaływania diwercyny AS7 z białkami człowieka (ALDOA, MAPRE1, RPL13A, SSR2) kluczowymi dla procesów molekularnych takich jak: translacja, transport wewnątrzkomórkowy oraz onkogeneza.
Rekombinowana diwercyna AS7 zachowuje aktywność bakteriobójczą i termostabilność, co umożliwia jej praktyczne zastosowanie. Nie wpływa cytotoksycznie na komórki Caco-2, co wskazuje na bezpieczeństwo jej stosowania, jako biokonserwantu żywności. Oddziałuje ona z białkami człowieka istotnymi dla prawidłowego przebiegu kluczowych procesów komórkowych i może stanowić potencjalny czynnik terapeutyczny.
Słowa kluczowe: diwercyna AS7, bakteriocyny, heterologiczna synteza, enterocyty człowieka, cytotoksyczność, oddziaływania białko – białko